0371-60972711
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2018-01-27 09:41:39 來源： 點擊：
從水中去除氮污染主要是依靠微生物的硝化-反硝化作用將氮元素轉化為N2逸出系統.目前, 各種常用的污水處理工藝在曝氣充足的情況下, 可將大部分氨氮轉化為硝態氮, 去除效果較為徹底.但由于碳源的缺乏, 反硝化作用往往不徹底, 致使污水廠尾水硝態氮和TN濃度普遍較高, 從而易導致尾水受納水體富營養化.為提高反硝化效果, 需要向污水處理系統中投加碳源, 其中, 水溶性碳源因具有易于溶解、反應速度快等特點而得到廣泛應用.常用的溶解性碳源有蔗糖、甲醇、乙酸等, 但投加溶解性碳源的成本較高, 且投加量難以控制, 易造成二次污染, 從而增加了污水處理系統的運行維護難度.近年來, 玉米芯、稻殼、稻草、木屑(Soares et al., 1998)及秸稈提取液等天然纖維素碳源作為反硝化碳源的相關研究逐漸成為熱點.固體纖維素碳源具有碳源釋放緩慢、可長效釋碳的優點.基于此, 本文結合前期對玉米芯反硝化碳源開展的相關研究, 將玉米芯和無機材料結合, 研發了緩釋碳源生態基質顆粒, 并使用反硝化反應器對其脫氮效果及脫氮機理開展研究.2 材料與方法 2.1 緩釋碳源生態基質特性 2.1.1 生態基質制備方法
將硅藻土、沸石粉、礦渣硅酸鹽水泥等無機材料與玉米芯按配比混勻, 玉米芯質量比為5%, 置入滾動造粒機造粒, 在20~25 r·min-1轉速下, 使用噴霧器向造粒機內不斷噴灑水霧, 使原料逐漸滾動成直徑9~12 mm的球形顆粒;將顆粒取出平鋪在平板上并放置于陰涼處, 每天早晚各灑水養護一次, 灑水至顆粒表面濕潤, 養護3~5 d后晾干即得到生態基質顆粒.
2.1.2 生態基質特性
生態基質顆粒實現了天然纖維素碳源與掛膜填料的結合, 可作為反硝化生物反應器、人工濕地等水處理技術的填料使用, 具有較高的應用價值.本文所研制的生態基質顆粒成品如圖 1a所示, 生態基質顆粒表面微觀結構(圖 1b)為類似活性炭的粗糙多孔結構, 具有比表面積大、易掛膜、傳質性好、可緩釋碳源等特點, 其基本參數如表 1所示.
2.2 實驗裝置
實驗裝置為有機玻璃水平流反應器, 有效容積10 L.生態基質的鋪設方式及鋪設量如下：在裝置內距出水端1/3位置處裝填緩釋碳源生態基質, 裝填體積為裝置體積的1/10, 其余部分填充礫石.裝填基質后裝置內空隙率為0.39, 實驗裝置如圖 2所示.使用計量泵進水, 出水外排.設置一組對照, 對照組內全部填充礫石, 其他條件與實驗組保持一致.
使用鄭州市金水河城區段(鄭州市某污水廠尾水受納水體)低碳氮比(<1)河水作為實驗用水, 水質狀況如表 2所示.
各指標的測試方法如下：COD測定采用HACH快速測定法;NH4+-N測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009);NO2--N測定采用分光光度法(GB 7493-87);NO3--N測定采用酚二磺酸分光光度法(GB 7480-87);TN測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012).
2.5 裝置的啟動
實驗組和對照組裝置使用計量泵進水, 進水流量為0.16 L·h-1, 水力停留時間為24 h.連續進水7 d后可見礫石表面和裝置內壁形成褐色生物膜, 裝置啟動完成.掛膜啟動完成后, 進水流量提高至0.32 L·h-1, 水力停留時間降低至12 h, 連續進水, 每天監測實驗組和對照組進出水的COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN指標, 連續監測25 d.
2.6 微生物多樣性分析
實驗結束后, 分別取生態基質組和礫石對照組裝置內相同位置的生態基質和礫石放入樣品管, 預處理后使用試劑盒法提取DNA, 按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書進行提取.使用瓊脂糖凝膠檢測提取DNA的完整性.
PCR擴增采用Miseq測序平臺的V3~V4通用引物：341F和805R.反應體系為：2×Taq master Mix 15 μL, Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1 μL, Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL, Genomic DNA 10~20 ng, H2O添加至30 μL.使用BIO-RAD T100TM Thermal Cyeler擴增儀進行第一輪擴增, 反應程序為：94 ℃預變性30 min, 進行5個循環(94 ℃變性30 s, 45 ℃退火20 s, 65 ℃延伸30 s), 接著進行20個循環(94 ℃變性30 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s), 最后72 ℃延伸5 min.第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物, 反應體系為：2×Taq master Mix 15 μL, Primer F(10 μmol·L-1) 1 μL, Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL, Genomic DNA 20 ng, H2O添加至30 μL.第二輪擴增反應程序為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性15 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸30 s, 進行5個循環;最后72 ℃延伸5 min.PCR結束后, PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測.對于細菌和古菌擴增的PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物, 選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理.對于真菌PCR產物和其他擴增片段小于400 bp的PCR產物, 選用0.8倍的磁珠處理進行DNA純化回收.使用Miseq測序平臺進行高通量測序.
數據處理：去除Miseq測序序列中的引物接頭序列, 再根據PE reads之間的overlap關系, 將成對的reads拼接成一條序列, 然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據, 最后對各樣本數據的質量進行質控過濾, 得到各樣本有效數據, 然后對數據進行優化處理.數據處理及統計完成后進行Alpha多樣性分析、物種分類分析和菌群差異分析.
2.7 數據處理方法
實驗數據使用Microsoft Excel 2013和SPSS 19軟件進行處理, 圖表使用Microsoft Excel 2013、Origin 8和AutoCAD 2014軟件繪制.
2.8 重復實驗
本實驗研究結束后, 使用同一裝置在相同參數條件下對各種形態氮的去除效果進行重復驗證.
3 結果與討論 3.1 生態基質對出水COD的影響
裝置掛膜啟動完成后, 兩組裝置進、出水COD情況如圖 3所示.前10 d裝填緩釋碳源生態基質顆粒的實驗組出水COD明顯高于對照組和進水, 進水COD為22~43 mg·L-1, 實驗組出水COD為32~86 mg·L-1, 對照組出水COD為20~83 mg·L-1.說明實驗期間生態基質顆粒正在釋放碳源, 碳源釋放量在5 d后基本穩定, 實驗組出水COD增加量基本保持在20 mg·L-1左右, 不會造成水體COD的突然升高, 實驗進行20 d后, 加上7 d掛膜時間, 生態基質已在水中浸泡接近1個月, 出水COD仍維持在40~55 mg·L-1, 說明生態基質穩定釋碳持續時間在1個月以上.
兩組裝置進、出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN濃度情況如圖 4所示, 對各形態氮的去除率如圖 5所示.由圖可知, 進水氨氮濃度為1.29~3.08 mg·L-1, 裝填生態基質的實驗組出水氨氮濃度為0.25~1.92 mg·L-1, 裝填礫石的對照組出水氨氮濃度為0.62~1.87 mg·L-1, 實驗組對氨氮的去除率接近50%, 略高于對照組.造成這一現象可能有兩方面原因：一是物理吸附作用, 生態基質顆粒的材料組成中包括沸石粉, 沸石具有吸氨能力;二是微生物作用, 生態基質顆粒具有較大的比表面積, 表面較為粗糙, 更有利于脫氮微生物的附著生長, 基質表面生物量更高.但硝化作用的進行不需要碳源, 生態基質對氨氮的去除效率沒有顯著影響.
硝態氮通過反硝化作用轉化為N2的過程可以用方程(1)表示, 該反應分為4步(式(2)~(5)), 且中間產物較多, 但NO、N2O為不穩定產物, 因此, 反硝化過程可使用兩步反硝化模型(Ni et al., 2008), 僅把NO2--N作為中間產物進行分析.
進水NO2--N濃度為0.33~2.05 mg·L-1, 實驗組出水NO2--N濃度為0~0.25 mg·L-1, 平均去除率為90.60%, 對照組出水NO2--N濃度為0.56~1.95 mg·L-1, NO2--N出現積累.進水NO3--N濃度為8.89~12.34 mg·L-1, 實驗組出水NO3--N濃度為0.24~3.05 mg·L-1, 平均去除率為90.32%, 對照組出水NO3--N濃度為7.76~13.21 mg·L-1, 平均去除率僅為25.06%.研究表明, 亞硝態氮的積累與碳氮比、碳源種類和反應器運行方式等因素有關.傳統碳源中, 醇類、乙酸/乙酸鈉、葡萄糖和蔗糖碳源在碳氮比小于3時易引起NO2--N積累.而天然纖維素碳源, 特別是玉米芯碳源釋碳持續時間長, 具有良好的脫氮效果, 且不易引起NO2--N積累.生態基質顆粒內的玉米芯釋放的纖維素碳源使碳氮比從2.0提高到3.5左右, 充足的碳源保證了反硝化作用的順利進行, 實驗組內NO2--N和NO3--N的去除率均達到90%以上, 而對照組內由于缺乏碳源, 反硝化作用受到抑制, 出水NO3--N濃度升高, NO2--N出現了明顯的積累現象.
實驗組出水TN平均去除率達到63.66%, 比對照組(25.06%)高, 這一結果與趙文莉等使用玉米芯碳源開展的反硝化脫氮實驗的TN去除率接近.在前期研究當中, 直接將玉米芯放置于反應器內作為反硝化碳源, 總氮去除率與本研究基本一致, 釋碳周期可達半年以上, 但反應器運行一段時間后, 由于玉米芯的軟化分解, 反應器內部出現基質塌陷情況, 這一現象也是造成天然纖維素碳源在實際工程工藝中應用較少的原因之一.而玉米芯碳源與無機骨架材料制成的生態基質顆粒可直接作為反應器內的填料使用, 有效避免了基質塌陷;此外, 玉米芯分解釋放完后, 生態基質內部出現的大量孔狀結構, 使生態基質顆粒可作為良好的微生物附著載體繼續發揮作用.
水質檢測結果表明, 實驗組對各種形態氮的去除效果均優于對照組, 生態基質顆粒釋放的碳源可提高碳氮比, 使反硝化作用第2階段(由NO2--N轉化為N2)的反應順利進行, 能夠有效地提高總氮的去除率.除碳源因素外, 導致實驗組和對照組亞硝態氮差別較大的另一個原因是溶解氧條件.在生態基質顆粒中的沸石粉、硅藻土等組分為多孔介質, 其中的孔隙形成許多缺氧、厭氧的微處理區, 為反硝化微生物提供了適宜的溶解氧條件, 有利于反硝化作用的進行, 而在剛性表面礫石填料則缺少厭氧條件.
本實驗研究結束后, 使用同一裝置在相同參數條件下對各種形態氮的去除效果進行重復驗證, 結果顯示, 生態基質組出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN的去除率分別為33.6%、88.7%、91.1%和67.3%, 對照組的去除率(積累率)分別為21.2%、-18.7%、-10.3%和29.2%.重復實驗對各種形態氮的去除率及濃度變化趨勢與本次實驗基本一致.
3.3 生態基質對微生物群落結構的影響 3.3.1 Alpha多樣性分析
Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的物種多樣性.將相似度大于97%的序列歸為一個OTU, 進行后續分析, 計算各個樣本的相關統計和分析指數, 包括：Chao1指數、覆蓋率(Coverage)、香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)等, 結果如表 4所示.結果中兩組樣本覆蓋率(Coverage)均在0.95以上, 說明本次實驗取樣合理, 測序的工作完成較好.生態基質組chao1指數大于礫石組, 表明生態基質組的物種總數更大.香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)分別體現樣品中物種的均勻度和多樣性.生態基質組的香農指數大于礫石組, 辛普森指數小于礫石組, 表明生態基質組的物種均勻度和物種豐富度高于礫石組.生態基質顆粒釋放的碳源對反應器內的菌種組成有明顯影響, 生態基質組反應器內微生物群落多樣性高于對照組.
為說明生態基質組和礫石組微生物組成的差異情況, 繪制屬水平下的物種豐度熱圖, 結果如圖 6所示.圖 6中每一列代表一個樣本, 行代表菌屬群落, 顏色塊代表菌屬相對豐度值, 顏色越紅表示相對豐度越高, 顏色越藍代表相對豐度越低.由圖 6可以看出, 生態基質組中Acinetobacter、Exiguobacterium、假單胞菌屬(Pseudomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、Mangroviflexus、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、固氮螺菌屬(Azospira)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、弗拉托氏菌屬(Frateuria)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Formivibrio、Saccharibacillus、Cellulosilyticum等菌屬相對豐度較高.其中, 熱單胞菌屬(Thermomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Dechloromonas、陶厄氏菌屬(Thauera)均已證實與反硝化有關.
值得指出的是, 生態基質組中出現了與纖維素降解有關的Cellulosilyticum菌屬和梭狀芽孢桿菌(Clostridium)兩個菌屬, Cellulosilyticum菌屬曾在牛瘤胃中分離出, 可以分解纖維素.這與玉米芯釋放的纖維素碳源有直接關系, 玉米芯釋放的纖維素被分解后更易被異養反硝化微生物利用, 促進反硝化作用的進行.
3.3.3 樣本間差異分析
NMDS非度量多維尺度分析：非度量多維尺度分析法是一種將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進行定位、分析和歸類, 同時又保留對象間原始關系的數據分析方法, 常用于比對樣本組之間的差異, 可以基于進化關系或數量距離矩陣.生態基質組和礫石組樣本間的非度量多維尺度分析結果如圖 7所示, 圖中橫坐標表示基于進化距離矩陣的數值(NMDS1), 縱坐標表示基于數量距離矩陣的數值(NMDS2).生態基質組和礫石組樣本在橫坐標上距離達到0.7以上, 在縱坐標上的距離為0.4左右, 兩組樣本間微生物群落組成差異較大.
脫氮微生物相對豐度差異分析：生態基質組相對豐度超過1%的主要菌屬有34個, 礫石組僅有9個.各樣品中主要的菌屬分布情況如圖 8所示.從圖 8可以看出, 生態基質組中的主要菌屬包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Mangroviflexus、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和熱單胞菌屬(Thermomonas);礫石組中的主要菌屬包括微桿菌屬(Exiguobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas).
生態基質組和礫石組樣本中的假單胞菌屬(Pseudomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Dechloromonas、陶厄氏菌屬(Thauera)、硝化菌屬(Nitrobacter)中均包含具有脫氮作用的菌種.以上脫氮菌屬在生態基質組和礫石組樣本中的相對豐度差異見表 5.由表 5可以看出, 生態基質組高通量樣本中具有亞硝化、硝化作用的菌屬相對豐度為0.01%, 具有反硝化作用的菌屬相對豐度為30.38%;礫石組樣本中具有亞硝化、硝化作用的菌屬相對豐度為0.2%, 具有反硝化作用的菌屬相對豐度為13.14%.
從高通量分析結果可以看出, 生態基質組反應器內具有反硝化作用的菌屬相對豐度顯著高于對照組, 生態基質釋放的碳源有利于異養反硝化微生物的生長繁殖.
3.3.4 微生物物種與脫氮效果相關分析
使用SPSS 19.0軟件對兩組樣本中菌屬相對豐度數據與TN去除率數據進行相關分析, 結果顯示, 熱單胞菌屬(Thermomonas)、Mangroviflexus、固氮螺菌屬(Azospira)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)4個菌屬的相對豐度與TN去除率有顯著相關性(p<0.05), 其中, 熱單胞菌屬(Thermomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)中均包含具有反硝化脫氮作用的菌種;固氮螺菌屬(Azospira)具有同化固氮的作用, 使水體中的無機氮轉化為菌體內的物質;Mangroviflexus菌屬是否具有脫氮作用目前還不明確, 需要進一步研究.
4 結論
1) 采用緩釋碳源生態基質作為填料進行生物反硝化脫氮, 可在保證出水有機物濃度沒有明顯升高的前提下有效降低低碳氮比水體中的氮濃度, 并避免了NO2--N和NO3--N的積累, 其中, TN去除率可達到60%以上, NO2--N和NO3--N去除率達到90%以上.
2) 生態基質顆粒釋放的碳源可提高系統內碳氮比, 促進反硝化過程第2階段反應的進行, 避免水體中NO2--N的積累;此外, 生態基質顆粒實現了玉米芯碳源與微生物生長載體的結合, 是水污染凈化材料的一次創新。
3) 高通量分析結果表明, 與分解纖維素有關的Cellulosilyticum菌屬和梭狀芽孢桿菌(Clostridium)菌屬的出現說明生態基質確實釋放了纖維素碳源, 纖維素分解后的單糖產物有利于異養反硝化微生物的生長繁殖, 使生態基質組中具有反硝化脫氮功能的熱單胞菌屬(Thermomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)相對豐度遠高于對照組;與TN去除率具有顯著相關性(p<0.05)的Mangroviflexus菌屬是否具有脫氮作用有待更多的研究證實.
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